安徽安庆地区外科院内感染常见革兰阴性菌感染耐药分析及相关机制研究
摘要：目的　了解安徽安庆地区外科院内感染特点及病原菌耐药情况，为临床合理使用抗菌药物和控制医院感染提供科学依据。方法　对2007年~2009年间外科院内感染病人送检的263株革兰阴性菌进行了药物敏感性检测，ESBLs(extended spectrum β-lactamase, 超广谱β内酰胺酶)的检测以及其亚型的分析。结果　肠杆菌属中没有发现对亚胺培南和美罗培南的耐药株，但是对氨苄西林呈现高度耐药，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对亚胺培南的敏感率都不低于70%。产β-内酰胺酶菌株埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。
关键词：感染; 病原菌; 耐药率; ESBL
 
Characteristics of gram negative bacteria and analysis of mechanisms of drug resistance in nosocomial infection patients in Ruian, Zhejiang Province
WU Qing-mei
(The Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou Zhejiang 325200, China)
Abstract: OBJECTIVE To understand the nosocomial infection and pathogenic resistance to drugs in general surgery department, in order to provide scientific basis for the rational clinical application of antibiotics and hospitals infection control. METHODS Test of drug resistance, detect of ESBLs and PCR were used to analysis characteristics of 263 strains of gram negative bacteria which collected from surgery department from 2007~2009. RESULTS There were no strains be found resistance to imipenem and meropenem in Enterobacter, but showed high resistance to ampicillin. The sensitive rate of Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii to imipenem not less than 70%. Detection rate of ESBLs in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were 71.4% and 50%, respectively. TEM type was the most common subtype had be found in this rearch, and the second was CTX-M. CTX-M-9 group take the largest part of CTX-M. CONCLUSIONS It is very important to systematically monitor the infection characteristics and the drug resistance by pathogens in surgery department. The results of this study provide the important data to guide the rational use of antibiotics and effective infection control measures.
 
Key words: Infection; Pathogens; Antimicrobial resistance; ESBL
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
近年来随着抗菌药物的广泛使用，细菌耐药性日趋严重，医院感染概率增加，其中革兰阴性菌的比例不断上升，严重困扰外科临床的治疗及预后^[1]。如何有效地预防和控制细菌耐药性的产生就成为当前困扰临床医生和基础研究者的难题。本文对浙江瑞安某医院2007年1月~2009年12月外科住院患者送检样本的主要革兰阴性菌构成及耐药情况进行总结分析，以便于加强院内感染病原菌的监控，指导合理使用抗菌药物，对于减少院内感染的发生，控制细菌耐药性增高和耐药谱的扩大和变迁具有重要意义。
1　材料与方法
1.1　资料来源：某院外科病房2007年1月~2009年12月住院患者的医院感染监测资料。标本取自外科医院感染患者送检的各种生物标本，包括: 尿液、痰液、血液、脑脊液、手术伤口分泌物、胆汁、胸水、腹水、粪便以及其他分泌物等，进行细菌培养和药物敏感试验，同一患者3日内的同一送检标本分离出同一菌株按1株计算。
1.2　诊断标准：根据卫生部卫医发(2001)2号《医院感染诊断标准》确定是否为医院感染。
1.3  菌株鉴定：菌株鉴定使用VITE2-COMPACT全自动细菌分析仪（生物梅里埃公司，法国）按全国临床检验操作规程常规方法分离培养。各种送检标本，获纯培养后用细菌鉴定卡进行细菌鉴定。
1.4  药敏试验：琼脂对倍稀释法测定13种抗菌药物耐药率。根据2009年临床与实验室标准（Clinical and Laboratory Standards Institute；CLSI）推荐的标准判定结果，质控细菌为E．coli ATCC25922和E．coli ATCC35218，质控菌实验结果均在CLSI控制范围内。
1.5  超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamase，ESBLs）的检测：对产生ESBLs的主要菌株埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌和肺炎克雷伯菌采用2009年CLSI推荐的ESBLs确证方法进行检测^[2]，埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603分别用作ESBLS试验的阴性和阳性对照。
1.6  引物设计与合成：根据GeneBank 数据库已收录的ESBLs 基因序列信息，采用Primer 5.0软件辅助设计，选择各型ESBLs 基因编码区保守序列设计型或亚型特异性通用引物，委托上海生工生物技术公司进行引物合成。采用多重PCR方法检测ESBLs耐药基因引物序列见表1。使用ABI7500 聚合酶链反应仪器（应用生物系统公司，美国）进行PCR扩增。
1.7  多重PCR扩增：分为Ⅰ、Ⅱ两组，Ⅰ组含TEM和SHV型2对引物，Ⅱ组含CTX-M型3对引物。反应体积为50μl，含1×PCR反应缓冲液，1.5mmol/L Mg，200 mmol/L dNTPs，引物各0.4μmol/L，Taq酶1.25U，DNA模板100～500ng。I组PCR反应参数为：94℃预变性3min，94℃45s，53℃45s，72℃55s，循环35次，最后72℃延伸5min。Ⅱ组PCR复性温度为55℃，其余反应参数同Ⅰ组。使用琼脂糖凝胶电泳法，以DNA Marker DL2000为参照物标准，在含0.5μg/ml溴化乙啶的1.2%琼脂糖凝胶中电泳后，用凝胶成像系统观察结果并照相。
 
2  结果
2.1  菌株分类：2007年1月~2009年12月该院外科病房共收治病人5847例，发生医院感染病人216例，院内感染发生率3.69%。送检各类样本279例，分离出病原菌337株，其中革兰阴性菌263株，占所有分离株的78.04%。具体组成见表2。
2.2  主要病原菌药物敏感性分析：埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌中未发现对亚胺培南和美罗培南耐药的菌株，敏感率为100%，其次为阿米卡星(72.48%)和头孢他啶(50.46%)。氨苄西林、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐药率都在80%以上，其中氨苄西林的耐药率达到了96.33%。肺炎克雷伯菌也没有发现亚胺培南和美罗培南的耐药株，对阿米卡星耐药率为72.22%；对氨苄西林的耐药率最高，达到96.3%。铜绿假单胞菌药物敏感率前三位抗菌药物依次为亚胺培南(74.47%)、哌拉西林-他唑巴坦(72.34%)、阿米卡星(72.34%)；头孢噻肟、头孢曲松和环丙沙星耐药率都高于55%。鲍氏不动杆菌抗菌药物敏感率为70%的有亚胺培南、美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦。具体情况见表3。
2.3  ESBLs菌株分类：共检测出携带产ESBL菌株91株，其中埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌65株，检出率达到71.4%，肺炎克雷伯菌27株，检出率为50%。PCR基因分型显示：TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。具体结果见表4。
 
3  讨论
自20世纪60年代开始，全球外科感染疾患的细菌谱大约每十年变更一次，其主要顺序是金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌→埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌、铜绿假单胞菌→肠杆菌属、不动杆菌属、克雷伯菌属，以及肠球菌和厌氧菌^[3]，革兰阴性菌在院内感染中所占比例不断升高，本研究结果显示已达到78.04%。近年来，我国有多篇文献报道证实外科感染常见细菌为埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌和铜绿假单胞菌^[4]。重视耐药菌株的分检率掌握本地区、本单位细菌的耐药菌的分离率及其对抗菌药物敏感性的变化有助于经验性选择抗菌药物。就抗菌药物应用而言，应用于临床历史较长的品种耐药菌株较多，新近问世的敏感率较高，如亚胺培南等。
和10年前相比,多数革兰阴性菌对各种抗菌药物的耐药率都有了不同程度的提高^[5]。本研究中埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌对环丙沙星的耐药率一般已超过80%，对其他氟喹诺酮类也相当耐药，这与国外资料有很大不同，其中不少是产超广谱β-内酰胺酶的菌株。非发酵菌,包括铜绿假单胞菌、不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌,耐药情况都很严重。总的看来，碳青霉烯类的亚胺培南和美罗培南抗菌谱最广，耐药程度最轻，但嗜麦芽窄食单胞菌对其天然耐药。杀菌活性居其次的是含有酶抑制剂的抗菌药物哌拉西林-他唑巴坦。
本研究中埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌产ESBLs菌株检出率较高，达到71.4%，符合国内相关报道[4]。推测原因是因为外科广泛、预防性联合应用广谱抗菌药物，以致耐药菌和条件致病菌更容易发生医院感染。ESBLs是革兰阴性杆菌最主要的耐药机制之一，ESBLs可以水解β-内酰胺类抗菌药物使其失效。对于产ESBLs菌株的治疗,可选用碳青霉烯类抗菌药物(如亚胺培南)或酶抑制剂复合抗菌药物进行治疗，同时应该减少β-内酰胺类抗菌药物的使用，以降低产ESBLs菌株的产生。铜绿假单胞菌是医院内感染的常见致病菌，对多种抗菌药物天然耐药，耐药机制复杂，主要包括产β-内酰胺酶、低渗透性作用、主动泵出系统及生物被膜形成等。
产ESBLs的细菌呈世界性流行，不同地区流行的ESBLs基因型不同。美洲的国家如美国主要流行TEM、SHV型ESBLs；阿根廷主要为CTX-M-型^[6]；欧洲的国家如西班牙主要流行CTX-M-10，其次SHV-2和TEM-4，意大利以TEM型为主，其次为SHV型，同时具有这两种基因型的占11%；希腊的两家医院的ESBLs基因型以SHV型为主（占63.7%），CTX-M型的ESBL占30.5%；亚洲国家日本流行Toho-1、SHV-2，中国也有CTX-M型、TEM型以及SHV型流行的报道^[7]。
本研究显示，该地区产ESBLs的埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌和肺炎克雷伯菌的主要为TEM型（72.83%），其次为CTX-M型（60.87%），其中以CTX-M-9组最为常见，与我国其他地区略有差异^[8]，推测该差别可能是由于各地区抗菌药物的使用习惯不同及院内携带ESBLs基因耐药质粒的菌株流行不同有关。
药物使用频率与耐药率成正相关。减少不必要的预防性治疗，对某些抗菌药物采取分期分批交替使用，治疗应根据药敏结果制定方案，正规有效使用抗菌药物，并尽量使用窄谱抗菌药物进行治疗，以最大限度减少耐药菌株的产生。了解本地区细菌耐药流行情况和规律，并对于耐药机制做出进一步的分析，有助于经验治疗的药物选择，有助于科学、合理地应用抗菌药物。
 
 
 
 
 
 
参考文献

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3. 乐三峰,吴兵. 基层卫生院外科感染病原菌耐药性分析[J].中华医院感染血杂志,2010,20(16):2517-2518.
4. 刘岩. 外科病房2651例院内感染的病原菌构成及耐药情况分析[J].临床医学,2010,23(8):2858-2860
5. 黎沾良. 外科感染常见病原菌及耐药现状[J].中国实用外科杂志,2007,27(12):937-939.
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表1 多重PCR所用引物

引物名称	引物序列	扩增片段(bp)		基因型特异性
TEM-up	5’-GTGTCGCCCTTATTCCC-3’	785	TEM
TEM-down	5’-CATAGTTGCCTGACTCCC-3’
SHV-up	5’-TGTATTATCTCCCTGTTAGC -3’	843	SHV
SHV-down	5’-TTAGCGTTGCCAGTGCTC-3’
CTX-M-1-up	5’-ACGCTGTTGTTAGGAAGTG-3’	759	CTX-M-1组
CTX-M-1-down	5’-TTGAGGCTGGGTGAAGT-3’
CTX-M-2-up	5’-CGACGCTACCCCTGCTAT-3’	832	CTX-M-2组
CTX-M-2-down	5’-CAGAAACCGTGGGTTACGA-3’
CTX-M-9-up	5’-TGGCGGCGCTGGAGAAA-3’	679	CTX-M-9组
CTX-M-9-down	5’-ACCAGAAYMAGCGGCGCACG-3’

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
表2 医院感染革兰阴性菌构成比

细菌	数值	百分比%
埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌	109	41.44
肺炎克雷伯菌	54	20.53
阴沟肠杆菌	15	5.70
产气肠杆菌	6	2.28
变形杆菌属	7	2.66
铜绿假单胞菌	47	17.87
鲍曼不动杆菌	20	7.60
其他革兰阴性菌	5	1.90
总计	263	100

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
表3 革兰阴性菌对抗菌药物的敏感率和耐药率（％）

抗菌药物	埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率分别达到71.4%和50%，PCR分型显示TEM型为最常见基因型，其次为CTX-M型，其中以CTX-M-9组最为常见。结论　为基因水平的流行分析提供理论依据，对指导临床合理使用抗菌药物，有效控制医院感染具有重要意义。埃希菌（109株）			肺炎克雷伯菌（54株）			其他杆菌属（28株）			铜绿假单胞菌（47株）			鲍曼不动杆菌（20株）
	S	I	R	S	I	R	S	I	R	S	I	R	S	I	R
亚胺培南	99.08	0.92	0	96.30	3.70	0	100	0	0	74.47	6.38	19.15	70.00	15.00	15.00
美罗培南	98.17	1.83	0	96.30	3.70	0	100	0	0	70.21	6.38	23.40	70.00	25.00	5.00
氨苄西林	2.75	0.92	96.33	1.85	1.85	96.30	10.71	0	89.29	57.45		42.55	30.00	25.00	40.00
哌拉西林－他唑巴坦	44.04	42.20	13.76	50.00	27.78	22.22	46.43	17.86	35.71	72.34		27.66	70.00		15.00
头孢吡肟	35.78	7.34	56.88	51.85	9.26	38.89	42.86	10.71	46.43	51.06	14.89	34.04	35.00	15.00	50.00
头孢他啶	50.46	9.17	40.37	55.56	7.41	37.04	35.71	7.14	57.14	63.83	6.38	29.79	30.00	10.00	60.00
头孢噻肟	26.61	5.50	67.89	38.89	12.96	48.15	25.00	14.29	60.71	8.51	31.91	59.57	15.00	40.00	45.00
头孢曲松	26.61	3.67	69.72	38.89	11.1	46.30	25.00	10.71	64.29	10.64	25.53	63.83	15.00	35.00	50.00
庆大霉素	16.00		84.00	24.07		75.93	32.14		67.86	51.06		48.94	35.00		65.00
阿米卡星	72.48		27.52	72.22		29.63	60.71		39.29	72.34		27.66	55.00		45.00
环丙沙星	11.01	2.75	86.24	27.78	3.70	68.52	28.57	3.57	67.86	27.66	12.77	59.57	25.00	5.00	75.00
左氧氟沙星	13.76	2.75	83.49	38.89	1.85	61.11	46.43	3.57	50.00	55.32	6.38	38.30	45.00	5.00	50.00
加替沙星	16.00	2.75	81.65	59.26	5.56	35.19	35.71	7.14	57.14	51.06	6.38	42.55	45.00	5.00	50.00

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
表4 多重PCR方法检测92株产ESBLs菌株分型结果

基因型	株数
TEM	67
SHV	12
CTX-M-1	21
CTX-M-2	9
CTX-M-9	33
TEM+SHV	3
TEM+CTX-M-1	13
TEM+CTX-M-9	19
SHV+CTX-M-1	2
SHV+CTX-M-9	5
CTX-M-1+ CTX-M-9	7